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一、材料、試劑和儀器
1、電子顯微鏡.
2、真空噴鍍儀.
3、干凈銅網(wǎng).
4、火棉膠.
5、鉑銥合金.
6、醋酸鈾水溶液.
7、展開儲(chǔ)備液(0.1mg/L細(xì)胞色素C,1mol/L醋酸銨).
8、醋酸異戊酯.
9、純化的質(zhì)粒DNA樣品.
10、滑石粉.
二、目的
觀察質(zhì)粒DNA在顯微鏡下的形態(tài),掌握質(zhì)粒DNA的電鏡制樣原理和方法.
三、原理
球狀蛋白質(zhì)一般都可以在低鹽溶液或蒸餾水表面形成不溶解的變性薄膜,若濃度合適,則肽鏈伸展形成蛋白質(zhì)單分子層.一般用堿性蛋白質(zhì)包圍帶負(fù)電的核酸分子,當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)展開時(shí),核酸也隨之展開,核酸的形態(tài)結(jié)構(gòu)將保持一定的完整性.然后將核酸分子撈到支持膜上,經(jīng)過負(fù)染色,就可以在電鏡下觀察.
四、操作步驟
1、稱取3克火棉膠溶解于100ml的醋酸異戊酯中,制成3％的溶液.
2、用滴管吸取該液,滴1－2滴于清潔的水面上,當(dāng)醋酸異戊酯揮發(fā)后,在水面上形成一層均勻的火棉膠膜.
3、用鑷子小心地將干凈的銅網(wǎng)間隔一定距離排列在膜上.
4、在這些銅網(wǎng)上輕輕覆蓋一張適當(dāng)大小的濾紙,待濾紙濕潤(rùn)后將濾紙連同銅網(wǎng)、火棉膠膜輕輕撈起,銅網(wǎng)向上放于一干凈培養(yǎng)皿中晾干備用.
5、將核酸樣品(濃度為5mg/ml-10mg/ml)加到展開溶液中,終濃度為1mg/ml-0.5mg/ml,作為上相液.
6、將重蒸水注入干凈的培養(yǎng)皿中,作為下相液.
7、將干凈的載玻片斜放在培養(yǎng)皿中,在水表面撒少量滑石粉,以指示單分子膜的展開情況.
8、取50ul左右的上相液,在離下相液表面1cm處輕輕滴到斜面上,使上相液緩緩觸及下相液表面并形成一層單分子膜.
9、用鑷子夾著銅網(wǎng),膜面朝下,輕輕沾取下相液表面的核酸分子.用濾紙吸去多余的液體,晾干備用.
10、用醋酸雙氧鈾染色15分鐘,蒸餾水洗3次,每次10分鐘,晾干備用.
11、在真空噴鍍儀中用鉑銥合金投影,以進(jìn)一步增加電子反差.
12、電鏡觀察.
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