激光掃描共聚焦顯微鏡（LaserscanningConfocalMicroscopy，簡稱 LSCM）是近代生物醫(yī)學圖象儀器的最重要發(fā)展之一，它是在熒光顯微鏡成象的基礎上加裝激光掃描裝置，使用紫外光或可見光激發(fā)熒光探針，利用計算機進行圖象處理，從而得到細胞或組織內(nèi)部微細結構的熒光圖象，以及在亞細胞水平上觀察諸如Ca2+、pH值、膜電位等生理信號及細胞形態(tài)的變化。已廣泛應用于細胞生物學、生理學、病理學、解剖學、胚胎學、免疫學和神經(jīng)生物學等領域，對生物樣品進行定性、定量、定時和定位研究具有很大的優(yōu)越性，為這些領域新一代強有力的研究工具。
創(chuàng)建于1983年的美國Meridian公司，在90年代推出的“激光掃描共聚焦顯微鏡”這一項具有劃時代的義意的高科技產(chǎn)品，曾獲得美國“政府新產(chǎn)品獎”和兩次“高科技領先技術獎”，它能達到每秒120幅畫面的高速掃描激光共聚焦觀察，可提供實時，真彩色的激光共聚焦原色圖象。我院最近引起的 ACASuLTIMA312是Meridian公司最新的高科技產(chǎn)品，為同類儀器中檔次最高、功能最全的精密儀器?，F(xiàn)以該儀器為例介紹激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)及其在細胞生物學中的應用。
1、激光掃描共聚焦顯微鏡成像原理及組成
有關共聚焦顯微鏡的某些技術原理，早在1957年就已提出，二十年后由Brandengoff在高數(shù)值孔徑透鏡裝置上改裝成功具有高清晰度的共聚焦顯微鏡，1985年WijnaendtsVanResandt發(fā)表了第工一篇有關激光掃描共聚焦顯微鏡在生物學中應用的文章，到了1987年，才發(fā)展成現(xiàn)在通常意義上的第工一代激光掃描共聚焦顯微鏡。
激光掃描共聚焦顯微鏡成像原理如圖1所示，激光器發(fā)出的激光束經(jīng)過擴束透鏡和光束整形鏡，變成一束直徑較大的平行光束，長通分色反射鏡使光束偏轉90度，經(jīng)過物鏡會聚在物鏡的焦點上，樣品中的熒光物質(zhì)在激光的激發(fā)下發(fā)射沿各個方向的熒光，一部分熒光經(jīng)過物鏡、長通分色反射鏡、聚焦透鏡、會聚在聚焦物鏡的焦點處，再通過焦點處的針孔，由檢測器接收。
從圖1中可以看出，只有在物鏡的焦平面上發(fā)出的熒光才夠到達檢測器，其它位置發(fā)出的光均不能過針孔。由于物鏡和會聚透鏡的焦點在同一光軸上，因而稱這種方式成像的顯微鏡為共聚焦顯微鏡為共聚顯微鏡。在成像過程中針孔起著關鍵作用，針孔直徑的大小不僅決定是以共聚焦掃描方式成像還是以普遍學顯微鏡掃描方式成像，而且對圖像的對比度和分辨率有重要的影響。
ACASULTIMa312采用快速鏡掃描或臺階掃描對樣品逐點掃描成像，由于樣品中不同的掃描點始終在物鏡和會聚透鏡的光軸上，因而它以相同的信噪比掃描整個樣品，掃描精度達0.1μm，掃描面積最大的為10cm×8cm，當激光逐點掃描樣品時，針孔后的光電倍增管也逐點獲得對應光點的共聚焦圖像，并將之轉化為數(shù)字信號傳輸至計算機，最終在屏幕上聚合成清晰的整個焦平面的共聚聚焦圖像。一個微動步進馬達控制栽物臺的升降，使焦平面依次位于標本的不同層面上，可以逐層獲得標本相應的光學橫斷面的圖像。這稱為“光學切片”。再利用計算機的圖像處理及三維重建軟件?？梢缘玫礁咔逦葋肀憩F(xiàn)標本的外形剖面，十分靈活、直觀地進行形態(tài)學觀察。
2、激光掃描共聚焦顯微鏡硬件和軟件系統(tǒng)
2.1ACASULTIMa312硬件及參數(shù)指標激光光源：氬離子激光（50mW的紫外光、999mW的可見光），能同時/順序/分別輸出紫外光和可見光，激發(fā)波長為351-364nm；488nm；514nm。計算機系統(tǒng)： 80586/133MHzPCI/80MBRAM/2000MBSCSI硬盤/150MBBernoulli盤驅動器/17’’大屏幕顯示器。共聚焦系統(tǒng)：計算機自動控制光路準調(diào)節(jié)；計算機控制孔徑校準；計算機調(diào)節(jié)孔徑大小；自動Z軸調(diào)節(jié)（最小0.1μm）。光學探測系統(tǒng)：3個測窗式PMT采集熒光；1 個CCD系統(tǒng)；12位的高速A/D轉換器。圖像分辨率：圖像大小1535×1535；像素最小距離：0.1μm；灰度為4096級。掃描方式：快速鏡掃描 DualScan臺階掃描；掃描精度0.1μm；掃描面積最大為10cm×8cm；掃描平面：XY和XZ和獨特點、線、面掃描。2.2激光掃描共聚焦顯微鏡軟件系統(tǒng)
ACASULTIMa312系統(tǒng)采用獨特設計的軟件將激光細胞儀與先進的計算機技術結合，產(chǎn)生快速、高效、靈活的操作系統(tǒng)，完備的數(shù)據(jù)采集、分析與管理功能?；谏镝t(yī)學研究有如下的軟件。
ImageAnalyze―對于單色、比色和三色標記的二維熒光圖像的定量分析，可產(chǎn)生透射光圖像重疊，同時AutoImage可多個區(qū)域的自動掃描和熒光定量，以及相同區(qū)域的時間順序掃描。RatioAnalysis和Kinetics―測定細胞內(nèi)的離子變化，可有點掃描、線掃描及圖像掃描三種測定形式，以監(jiān)測各種速率的生物反應。Cell?CCellCommunicationandFRAP-相鄰細胞的FRAP分析。該軟件首先用可光淬滅特異的細胞熒光，然后在多個時間點掃描，此掃描可對單一區(qū)域或細胞的多個選擇區(qū)域，可產(chǎn)生透射光圖像并與其它圖像重疊。CellList―儲存被選擇細胞的位置，即可自動對較大樣品進行掃描，又可產(chǎn)生較小樣品特異部位的網(wǎng)絡位置表，以進行自動的測量、篩選和重復測定。CellSorting―ACAS具備如下四種分選方式：AblationSort:預選定義一個熒光閾值，然后對特定細胞殺傷。②CookieCutterSort在用戶定義的中心點四周切割Cookies。③QuickSort：對已定義的細胞表列，用Ablation或CookieCutter作分選。④ManualSort：直接使用鼠標控制載物臺位置及激光脈沖，并殺滅和分選細胞，進行細胞顯微外科，染色體切割和光隱阱等操作。ConfocalImaging―共聚焦分析，可實現(xiàn)Z 軸定量，三維立體圖像分析（包括SFP模擬熒光處理法，DP深度投影法和SP文體投影法），以及視點移動動畫。
3激光掃描共聚焦顯微鏡在細胞生物學中的應用
3.1定量熒光測量
ACAS可進行重復性極佳的低光探測及活細胞熒光定量分析。利用這一功能既可對單個細胞或細胞群的溶酶體，線粒體、DNA、RNA和受體分子含量、成份及分布進行定性及定量測定，還可測定諸如膜電位和配體結合等生化反應程度。此外，還適用于高靈敏度快速的免疫熒光測定，這種定量可以準確監(jiān)測抗原表達，細胞結合和殺傷及定量的形態(tài)學特性，以揭示諸如腫瘤相關抗原表達的準確定位及定量信息。
3.2定量共聚焦圖像分析
借助于ACAS激光共焦系統(tǒng)，可以獲得生物樣品高反差、高分辨率、高靈敏度的二維圖像?？傻玫酵暾畹幕蚬潭ǖ募毎敖M織的系列及光切片，從而得到各層面的信息，三維重建后可以揭示亞細胞結構的空間關系。能測定細胞光學切片的物理、生物化學特性的變化，如DNA含量、RNA含量、分子擴散、胞內(nèi)離子等，亦可以對這些動態(tài)變化進行準確的定性、定量、定時及定位分析。
3.3三維重組分析生物結構
ACAS使用SFP進行三維圖像重組，SFP將各光學切片的數(shù)據(jù)組合成一個真實的三維圖像，并可從任意角度觀察，也可以借助改變照明角度來突出其特征，產(chǎn)生更生動逼真的三維效果。
3.4動態(tài)熒光測定
Ca2+、pH及其它細胞內(nèi)離子測定，利用ACAS能迅速對樣品的點，線或二維圖像掃描，測量單次、多次單色、雙發(fā)射和三發(fā)射光比率，使用諸如 Indo-1、BCECF、Fluo-3等多種熒光探針對各種離子作定量分析。可以直接得到大分子的擴散速率，能定量測定細胞溶液中Ca2+對腫瘤啟動因子、生長因子及各種激素等刺激的反應，以及使用雙熒光探針Fluo-3和CNARF進行Ca2+和pH的同時測定。
3.5熒光光漂白恢復（FRAP）--活細胞的動力學參數(shù)
熒光光漂白恢復技術借助高強度脈沖式激光照射細胞某一區(qū)域，從而造成該區(qū)域熒光分子的光淬滅，該區(qū)域周圍的非淬滅熒光分子將以一定速率向受照區(qū)域擴散，可通過低強度激光掃描探測此擴散速率。通過ACAS可直接測量分子擴散率、恢復速度，并由此而揭示細胞結構及相關的機制。
3.6胞間通訊研究
動物細胞中由縫隙連接介導的胞間通訊被認為在細胞增殖和分化中起非常重要的作用。ACAS可用于測定相鄰植物和動物細胞之間細胞間通訊，測量由細胞縫隙連接介導的分子轉移，研究腫瘤啟動因子和生長因子對縫隙連接介導的胞間通訊的抑制作用，以及胞內(nèi)Ca2+,PH和cAMP水平對縫隙連接的調(diào)節(jié)作用。
3.7細胞膜流動性測定
ACAS設計了專用的軟件用于對細胞膜流動性進行定量和定性分析。熒光膜探針受到極化光線激發(fā)后，其發(fā)射光極性依賴于熒光分子的旋轉，而這種有序的運動自由度依賴于熒光分子周圍的膜流動性，因此極性測量間接反映細胞膜流動性。這種膜流動性測定在膜的磷脂酸組成分析、藥物效應和作用位點，溫度反應測定和物種比較等方面有重要作用。
3.8籠鎖―解籠鎖測定
許多重要的生活物質(zhì)都有其籠鎖化合物，在處于籠鎖狀態(tài)時，其功能被封閉，而一旦被特異波長的瞬間光照射后，光活化解籠鎖，使其恢復原有活性和功能，在細胞的增值、分化等生物代謝過程中發(fā)揮功能。利用ACAS可以人為控制這種瞬間光的照射波長和時間，從而達到人為控制多種生物活性產(chǎn)物和其它化合物在生物代謝中發(fā)揮功能的時間和空間作用。
3.9粘附細胞分選
ACAS是目前唯工一能對粘附細胞進行分離篩選的分析細胞學儀器，它對培養(yǎng)皿底的粘附細胞有兩種分選方法：（1）Coolie-CutterTM 法，它是Meidian公司技術，首先將細胞貼壁培養(yǎng)在特制培養(yǎng)皿上，然后用高能量激光的欲選細胞四周切割成八角形幾何形狀，而非選擇細胞則因在八角形之外而被去除，該分選方式特別適用于選擇數(shù)量較少諸如突變細胞、轉移細胞和雜交瘤細胞，即使百萬分之一機率的也非常理想。（2）激光消除法，該方法亦基于細胞形態(tài)及熒光特性，用高能量激光自動殺滅不需要的細胞，留下完整活細胞亞群繼續(xù)培養(yǎng)，此方法特別適于對數(shù)量較多細胞的選擇。
3.10細胞激光顯微外科及光陷阱技術
借助ACAS可將激光當作“光子刀”使用，借此來完成諸如細胞膜瞬間穿孔、切除線粒體、溶酶體等細胞器、染色體切割、神經(jīng)元突起切除等一系列細胞外科手術。通過ACAS光陷阱操作來移動細胞的微小顆粒和結構，該新技術廣泛用于染色體、細胞器及細胞骨架的移動。
4、結語
激光掃描共聚焦顯微鏡是近十年發(fā)展起來的醫(yī)學圖像分析儀器，與傳統(tǒng)的光學顯微鏡相比，大大地提高了分辨率，能得到真正具有三維清晰度的原色圖象。并可探測某些低對比度或弱熒光樣品，通過目鏡直接觀察各種生物樣品的弱自發(fā)熒光。能動態(tài)測量Ca2+、pH值，Na1+、Mg2+等影響細胞代謝的各種生理指標，對細胞動力學研究有著重要的意義。同時激光掃描共聚顯微鏡可以處理活的標本，不會對標本造成物理化學特性的破壞，更接近細胞生活狀態(tài)參數(shù)測定?？梢娂す鈷呙韫簿劢癸@微鏡是普遍顯微鏡上的質(zhì)的飛躍，是電子顯微鏡的一個補充，現(xiàn)已廣泛用于熒光定量測量，共焦圖像分析，三維圖像重建、活細胞動力學參數(shù)分析和胞間通訊研究等方面，在整個細胞生物學研究領域有著廣闊的應用前景。
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