一．相差鏡檢法(Phasecontrast)
在光學顯微鏡的發(fā)展過程中,相差鏡檢術的發(fā)明成功,是近代顯微鏡技術中的重要成就.我們知道,人眼只能區(qū)分光波的波長(顏色)和振幅(亮度),對于無色通明的生物標本,當光線通過時,波長和振幅變化不大,在明場觀察時很難觀察到標本.
相差顯微鏡利用被檢物體的光程之差進行鏡檢,也就是有效地利用光的干涉現(xiàn)象,將人眼不可分辨的相位差變?yōu)榭煞直娴恼穹?即使是無色透明的物質也可成為清晰可見.這大大便利了活體細胞的觀察,因此相差鏡檢法廣泛應用于倒置顯微鏡.
相差顯微鏡的基本原理是,把透過標本的可見光的光程差變成振幅差,從而提高了各種結構間的對比度,使各種結構變得清晰可見.光線透過標本后發(fā)生折射,偏離了原來的光路,同時被延遲了1/4λ(波長),如果再增加或減少1/4λ,則光程差變?yōu)?/2λ,兩束光合軸后干涉加強,振幅增大或減下,提高反差.在構造上,相差顯微鏡有不同于普通光學顯微鏡兩個特殊之處:
1.環(huán)形光闌(annulardiaphragm)位于光源與聚光器之間,作用是使透過聚光器的光線形成空心光錐,焦聚到標本上.
2.相位板(annularphaseplate)在物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板,可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ.分為兩種:
1.A+相板:將直射光推遲1/4λ,兩組光波合軸后光波相加,振幅加大,標本結構比周圍介質更加變亮,形成亮反差(或稱負反差).
2.B+相板:將衍射光推遲1/4λ,兩組光線合軸后光波相減,振幅變小,形成暗反差(或稱正反差),結構比周圍介質更加變暗
二．暗視野觀察(Darkfield)
暗視野實際是暗場照明發(fā).它的特點和明視野不同,不直接觀察到照明的光線,而觀察到的是被檢物體反射或衍射的光線.因此,視場成為黑暗的背景,而被檢物體則呈現(xiàn)明亮的象.
暗視野的原理是根據(jù)光學上的丁道爾現(xiàn)象,微塵在強光直射通過的情況下,人眼不能觀察,這是因為強光繞射造成的.若把光線斜射它,由于光的反射,微粒似乎增大了體積,為人眼可見.
m..m暗視野觀察所需要的特殊附件是暗視野聚光鏡.它的特點是不讓光束由下至上的通過被檢物體,而是將光線改變途徑,使其斜射向被檢物體,使照明光線不直接進入物鏡,利用被檢物體表面反射或衍射光形成的明亮圖象.暗視野觀察的分辨率遠高于明視野觀察,最高達0.02—0.004
三．明視野觀察(Brightfield)
明視野鏡檢是大家比較熟悉的一種鏡檢方式,廣泛應用于病理、檢驗,用于觀察被染色的切片,所有顯微鏡均能完成此功能.
四.偏光顯微鏡(Polarizingmicroscope)
偏光顯微鏡的特點
偏光顯微鏡是鑒定物質細微結構光學性質的一種顯微鏡.凡具有雙折射的物質,在偏光顯微鏡下就能分辨的清楚,當然這些物質也可用染色發(fā)來進行觀察,但有些則不可能,而必須利用偏光顯微鏡.
偏光顯微鏡的特點,就是將普通改變?yōu)槠膺M行鏡檢的方法,以鑒別某一物質是單折射(各向同行)或雙折射性(各向異性).
雙折射性是晶體的基本特性.因此,偏光顯微鏡被廣泛地應用在礦物,化學等領域.在生物學和植物學也有應用.
五．微分干涉稱鏡檢術(DifferentialinterferencecontrastDIC)
微分干涉鏡檢術出現(xiàn)于60年代,它不僅能觀察無色透明的物體,而且圖象呈現(xiàn)出浮雕壯的立體感,并具有相襯鏡檢術所不能達到的某些優(yōu)點,觀察效果更為逼真.
原理;
微分干涉稱鏡檢術是利用特制的渥拉斯頓棱鏡來分解光束.分裂出來的光束的振動方向相互垂直且強度相等,光束分別在距離很近的兩點上通過被檢物體,在相位上略有差別.由于兩光束的裂距極小,而不出現(xiàn)重影現(xiàn)象,使圖象呈現(xiàn)出立體的三維感覺.
DIC顯微鏡的物理原理完全不同于相差顯微鏡,技術設計要復雜得多.DIC利用的是偏振光,有四個特殊的光學組件:偏振器(polarizer)、DIC棱鏡、DIC滑行器和檢偏器(analyzer).偏振器直接裝在聚光系統(tǒng)的前面,使光線發(fā)生線性偏振.在聚光器中則安裝了偌瑪斯斯棱鏡,即DIC棱鏡,此棱鏡可將一束光分解成偏振方向不同的兩束光(x和y),二者成一小夾角.聚光器將兩束光調整成與顯微鏡光軸平行的方向.最初兩束光相位一致,在穿過標本相鄰的區(qū)域后,由于標本的厚度和折射率不同,引起了兩束光發(fā)生了光程差.在物鏡的后焦面處安裝了第二個偌瑪斯斯棱鏡,即DIC滑行器,它把兩束光波合并成一束.
這時兩束光的偏振面(x和y)仍然存在.最后光束穿過第二個偏振裝置,即檢偏器.在光束形成目鏡DIC影像之前,檢偏器與偏光器的方向成直角.檢偏器將兩束垂直的光波組合成具有相同偏振面的兩束光,從而使二者發(fā)生干涉.x和y波的光程差決定著透光的多少.光程差值為0時,沒有光穿過檢偏器;光程差值等于波長一半時,穿過的光達到最大值.于是在灰色的背景上,標本結構呈現(xiàn)出亮暗差.為了使影像的反差達到最佳狀態(tài),可通過調節(jié)DIC滑行器的縱行微調來改變光程差,光程差可改變影像的亮度.調節(jié)DIC滑行器可使標本的細微結構呈現(xiàn)出正或負的投影形象,通常是一側亮,而另一側暗,這便造成了標本的人為三維立體感,類似大理石上的浮雕
六:熒光顯微鏡(FluorescenceMicroscopy)
熒光鏡檢術是用短波長的光線照射用熒光素染色過的被檢物體,使之受激發(fā)后而產生長波長的熒光,然后觀察.
優(yōu)點:
·檢出能力高(放大作用)
·對細胞的刺激小(可以活體染色)
·能進行多重染色
用途:
·物體構造的觀察——熒光素
·熒光的有無、色調比較進行物質判別——抗體熒光等
·發(fā)熒光量的測定對物質定性、定量分析
六.浮雕相襯顯微鏡(RC)
1975年,RobertHoffman博士發(fā)明
2002年,到期,各顯微鏡廠家紛紛推出采用以自己名義命名的RC技術產品
原理
斜射光照射到標本產生折射、衍射,光線通過物鏡光密度梯度調節(jié)器產生不同陰影,從而使透明標本表面產生明暗差異,增加觀察對比度
特點
提高未染色標本的可見性和對比度;
圖象顯示陰影或近似三維結構而不會產生光暈;
可檢測雙折射物質(巖石切片、水晶、骨頭);
可檢測玻璃,塑料等培養(yǎng)皿中的細胞,器官和組織;
聚光鏡的工作距離可以設計的更長;
RC物鏡也可用于明場,暗場和熒光觀察
本文關鍵詞:顯微鏡,觀察方法
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